一、通用内参抗体定义及应用

内参蛋白即内部参照蛋白，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

所有WB实验都需要内参，用以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

二、内参抗体使用方法

1.标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。

2.普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

3.当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行。

三、在种类繁多的内参抗体中，如何选择合适的内参抗体至关重要

1.考虑目的蛋白分子量，一般需要与目的蛋白分子量相差5kD以上。

2.根据蛋白表达位置选择不同的内参，不同细胞器选择的内参也不同。参考如图
 

3.考虑组织特异性。以下为各种小鼠组织中常见内参的表达水平，供大家参考。
 

4.考虑试验处理条件对于内参表达的影响。

由于GAPDH是糖酵解过程中的酶，所以关于糖代谢的研究（如糖尿病模型）不能选择GAPDH作为内参；而某些细胞中，缺氧也会影响GAPDH的表达，此时也不可以选择GAPDH作为内参；将肿瘤组织与正常组织相比时，更好也不要选择GAPDH作为内参，因为很多肿瘤组织中的GAPDH相对于正常组织是高表达的，并且有文献报道GAPDH可以作为肿瘤标志物。

1) 做细胞骨架相关的研究时不能选择β-actin作为内参；

2) 做细胞毒性实验时，TBP和Lamin B会发生变化，此时不可以选择其作为内参；

3) 在加入抗癌和抗真菌药物时，Tubulin的表达易受影响，不适合作为内；

4) PCNA不适合作为非增殖细胞的内参等。

5.不同的组织特异性

actin 即肌动蛋白，有6种异构体，存在组织分布特异性。β-actin作为内参是得到了公认的，但是也有特殊情况，比如脂肪组织中 β-actin含量就很低，在肌肉组织中beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的组织本来就应该选择不同的内参，不能一概而论。

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