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试剂组成和配制:
酸性提取液:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。
碱性提取液:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 7.5mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 2.5mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 7.5mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂 4℃保存;
标准品:液体 1mL×1 支,10μmol/mL 柠檬酸标准液,4℃保存。
测定意义:
CA是线粒体三羧酸循环的第一个中间产物,由柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸合成,其含量是三羧酸循环强度的主要指标之一。
配合测定丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性、乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量,其中(1)丙酮酸含量和丙酮酸脱氢酶活性变化可以反映糖酵解进行程度,(2)综合分析丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性和乙酰CoA含量变化可以反映脂肪酸β-氧化途径提供的乙酰CoA 情况,(3)乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量变化可以反映三羧酸循环进行状况。
测定原理:
CA在柠檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸);在弱酸性条件下,α-酮酸进一步与苯肼反应,生成相应的α-酮酸苯腙;α-酮酸苯腙在330nm处有吸收峰,该波长下吸光度的变化程度可反映出CA的含量。